Индуцированные стволовые клетки

Индуцированные стволовые клетки (iSC) - это стволовые клетки , полученные из соматических , репродуктивных, плюрипотентных или других типов клеток путем преднамеренного эпигенетического перепрограммирования. Они классифицируются как тотипотентные (iTC), плюрипотентные (iPSC) или прогениторные (мультипотентные – iMSC, также называемые индуцированными мультипотентными клетками – предшественниками – iMPC) или унипотентные (iUSC) в зависимости от их потенциала развития и степени дедифференцировки . Прародители получают путем так называемого прямого перепрограммирования или направленной дифференцировки, а также называются индуцированными соматическими стволовыми клетками .

Широко известны три метода:

1. Трансплантация ядер, взятых из соматических клеток, в ооцит (яйцеклетку), лишенный собственного ядра (удалена в лаборатории)
2. Слияние соматических клеток с плюрипотентными стволовыми клетками и
3. Трансформация соматических клеток в стволовые клетки, используя генетический материал, кодирующий белок перепрограммирования факторов,рекомбинантные белки; микроРНК,синтетический, самовоспроизводящихся polycistronic РНК и низкомолекулярных биологически активных веществ.

==Естественные процессы

В 1895 году Томас Морган удалил одну из двух бластомер лягушки и обнаружил, что амфибии способны формировать целый эмбрион s из оставшейся части. Это означало, что клетки могут изменять свой путь дифференцировки. В 1924 году Шпеман и мангольд продемонстрировали ключевое значение клеточно-клеточных индукций в развитии животных.[20] обратимая трансформация клеток одного дифференцированного клеточного типа в другой называется метаплазией .[21] этот переход может быть частью нормального процесса созревания или вызван каким-либо побуждением.

Одним из примеров является трансформация клеток радужки в клетки хрусталика в процессе созревания и трансформация клеток пигментного эпителия сетчатки в нервную сетчатку при регенерации в глазах взрослых тритонов. Этот процесс позволяет организму заменить клетки, не соответствующие новым условиям, на более подходящие новые клетки. У Дрозофилы имагинальные диски, клетки должны выбирать из ограниченного числа стандартных дискретных состояний дифференцировки. Тот факт, что трансдетерминация (изменение пути дифференцировки) часто происходит для группы клеток, а не для отдельных клеток, показывает, что она индуцируется, а не является частью созревания.[22]

Исследователям удалось выявить минимальные условия и факторы, которые были бы достаточны для запуска каскада молекулярных и клеточных процессов, чтобы научить плюрипотентные клетки организовывать эмбрион . Они показали , что противоположные градиенты костного морфогенетического белка (BMP) и узлового , двух членов семейства трансформирующих факторов роста, которые действуют как морфогены , достаточны для индуцирования молекулярных и клеточных механизмов, необходимых для организации, in vivo или in vitro, незафиксированных клеток полюса животного бластулы зебры в хорошо развитый эмбрион .[23]

Некоторые типы зрелых, специализированных взрослых клеток могут естественным образом вернуться к стволовым клеткам. Например," главные " клетки экспрессируют маркер стволовой клетки Troy. Хотя они обычно производят пищеварительные жидкости для желудка, они могут вернуться в стволовые клетки, чтобы сделать временный ремонт травм желудка, таких как порез или повреждение от инфекции. Более того, они могут осуществить этот переход даже при отсутствии заметных повреждений и способны восполнять целые желудочные единицы, по сути служа спокойным "резервом" стволовых клеток. Дифференцированные эпителиальные клетки дыхательных путей могут превращаться в стабильные и функциональные стволовые клетки in vivo . После травмы зрелые терминально дифференцированные клетки почек дифференцируются в более примордиальные варианты самих себя и затем дифференцируются в типы клеток, нуждающиеся в замене в поврежденной ткани макрофаги могут самообновляться путем локальной пролиферации зрелых дифференцированных клеток. У тритонов мышечная ткань регенерируется из специализированных мышечных клеток, которые дедифференцируются и забывают тип клетки, в которой они были. Эта способность к регенерации не снижается с возрастом и может быть связана с их способностью производить новые стволовые клетки из мышечных клеток по требованию.

Различные нетуморигенные стволовые клетки проявляют способность генерировать несколько типов клеток. Например, мультилинейные дифференцирующие стресс-устойчивые (Муз) клетки являются стрессоустойчивыми стволовыми клетками взрослого человека, которые могут самообновляться. Они образуют характерные клеточные кластеры в суспензионной культуре, которые экспрессируют набор генов, связанных с плюрипотентностью , и могут дифференцироваться в эндодермальные, эктодермальные и мезодермальные клетки как in vitro, так и in vivo.

Другие хорошо документированные примеры трансдифференциации и их значение в развитии и регенерации были подробно описаны.

Индуцированные тотипотентные клетки SCNT-опосредованный

Индуцированные тотипотентные клетки могут быть получены путем перепрограммирования соматических клеток с ядерным переносом соматических клеток (SCNT). Процесс включает высасывание ядра соматической (телесной) клетки и введение его в яйцеклетку, у которой было удалено ядро [3] [5] [37] [38] [39] [40]

Использование подхода, основанного на протоколе, изложенном Тачибаной и др., [3] hESCs могут быть получены с помощью СКНТ с использованием ядер дермальных фибробластов как от 35-летнего мужчины среднего возраста, так и от пожилого, 75-летнего мужчины, предполагая, что возрастные изменения не обязательно препятствуют ядерному перепрограммированию человеческих клеток на основе СКНТ.[41] такое перепрограммирование соматических клеток в плюрипотентное состояние обладает огромным потенциалом для регенеративной медицины . К сожалению, клетки, полученные с помощью этой технологии, потенциально не полностью защищены от иммунной системы пациента (донора ядер), поскольку они имеют ту же митохондриальную ДНК, что и донор ооцитов, а не митохондриальную ДНК пациента. Это снижает их ценность в качестве источника для аутологичной трансплантационной терапии стволовыми клетками, поскольку в настоящее время не ясно, может ли он индуцировать иммунный ответ пациента при лечении.

Индуцированные андрогенетические гаплоидные эмбриональные стволовые клетки могут использоваться вместо спермы для клонирования. Эти клетки, синхронизированные в фазе M и введенные в яйцеклетку, могут производить жизнеспособное потомство.[43]

Эти разработки вместе с данными о возможности получения неограниченного количества ооцитов из митотически активных репродуктивных стволовых клеток [44] открывают возможность промышленного производства трансгенных сельскохозяйственных животных. Повторное реклонирование жизнеспособных мышей с помощью метода SCNT, включающего ингибитор гистоновой деацетилазы, трихостатин, добавляемый в клеточную культуральную среду, [45] показывает, что можно бесконечно реклонировать животных без видимого накопления перепрограммирования или геномных ошибок [46] однако исследование технологий разработки сперматозоидов и яйцеклеток из стволовых клеток поднимает биоэтические вопросы.[47]

Такие технологии могут также иметь далеко идущие клинические применения для преодоления цитоплазматических дефектов в ооцитах человека.[3] [48] например, технология смогла предотвратить унаследованное митохондриальное заболевание от передачи к будущим поколениям. Митохондриальный генетический материал передается от матери к ребенку. Мутации могут вызывать сахарный диабет, глухоту, нарушения зрения, желудочно-кишечные расстройства, болезни сердца, слабоумие и другие неврологические заболевания. Ядро из одной человеческой яйцеклетки было перенесено в другую, включая ее митохондрии, создавая клетку, которая могла бы рассматриваться как имеющая двух матерей. Затем яйцеклетки были оплодотворены, и полученные эмбриональные стволовые клетки несли обмененную митохондриальную ДНК. В качестве доказательства того, что методика безопасна автор этого метода указывает на существование здоровых обезьян, которым сейчас более четырех лет – и которые являются продуктом митохондриальных трансплантатов на разных генетических фонах.

В мышах позднего поколения теломеразодефицитных (Terc -/ -), SCNT− опосредованное перепрограммирование уменьшает дисфункцию теломер и митохондриальные дефекты в большей степени, чем перепрограммирование на основе iPSC.

Были описаны и другие достижения в области клонирования и тотипотентной трансформации.

Получено без SCNT

В последнее время некоторым исследователям удалось получить тотипотентные клетки без помощи SCNT. Тотипотентные клетки были получены с использованием эпигенетических факторов, таких как зародышевая изоформа гистона ооцитов. Перепрограммировать внутри-vivo, транзиторной индукцией 4 факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc в мышах, совещается характеристики totipotency. Внутрибрюшинная инъекция таких клеток ИПС in vivo генерирует эмбриоподобные структуры, которые экспрессируют эмбриональные и экстраэмбриональные ( трофэктодермальные ) маркеры. Потенциал развития мышиных плюрипотентных стволовых клеток для получения как эмбриональных, так и экстраэмбриональных линий также может быть расширен дефицитом микроРНК miR-34a, приводящим к сильной индукции эндогенных ретровирусов MuERV-L (MERVL).

Омоложение до iPSCs

Основная статья: Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

ИПСК были впервые получены в виде трансплантируемой тератокарциномы, индуцированной трансплантатами, взятыми из эмбрионов мыши. Тератокарцинома формируется из соматических клеток. генетически мозаичные мыши были получены из клеток злокачественной тератокарциномы, что подтверждает плюрипотентность клеток. оказалось, что клетки тератокарциномы способны поддерживать культуру плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток в недифференцированном состоянии, снабжая питательную среду различными факторами. В 1980-х годах стало ясно, что пересадка плюрипотентных/эмбриональных стволовых клеток в организм взрослых млекопитающих , как правило, приводит к образованию тератом, которые затем могут превратиться в злокачественную опухоль тератокарциномы.[63] однако, помещая клетки тератокарциномы в эмбрион на стадии бластоцисты, они становились включенными во внутреннюю клеточную массу и часто производили нормальное химерное (т. е. состоящее из клеток разных организмов) животное. Это указывало на то, что причиной возникновения тератомы является диссонанс - взаимное непонимание между молодыми донорскими клетками и окружающими взрослыми клетками (так называемая " ниша "реципиента).

В августе 2006 года японские исследователи обошли потребность в яйцеклетке, как и в SCNT. Перепрограммируя эмбриональные фибробласты мыши в плюрипотентные стволовые клетки посредством эктопической экспрессии четырех транскрипционных факторов , а именно Oct4 , Sox2 , Klf4 и c-Myc, они доказали, что чрезмерная экспрессия небольшого числа факторов может подтолкнуть клетку к переходу в новое стабильное состояние, связанное с изменениями активности тысяч генов

Таким образом, механизмы перепрограммирования связаны, а не независимы и сосредоточены на небольшом количестве генов.[67] Свойства IPSC очень похожи на ЭСК.[68] было показано, что IPSC поддерживают развитие мышей all-iPSC с использованием тетраплоидного (4n) эмбриона, [69] наиболее строгий анализ потенциала развития. Однако некоторые генетически нормальные IPSC не смогли произвести мышей all-iPSC из-за аберрантного эпигенетического замалчивания импринтированного кластера Dlk1-Dio3 гена.[18] Команда, возглавляемая Хансом Шолером (который открыл ген Oct4 еще в 1989 году), показала, что чрезмерная экспрессия Oct4 приводит к массивной активации гена вне мишени во время перепрограммирования, ухудшая качество IPSC. По сравнению с ОСКМ (Oct4, Sox2, Klf4 и с-ТУС), которые показывают аномальные импринтинга и дифференциация моделей, СКМ (Sox2, Klf4 и с-ТУС) создает перепрограммирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с высоким развивающим потенциалом (почти в 20 раз выше, чем у ОСКМ) эквивалентно эмбриональных стволовых клеток, а определяется их способностью генерировать все-ИПСК мыши через тетраплоидных эмбрионов дополнения[70][71]

Важным преимуществом iPSC по сравнению с ESC является то, что они могут быть получены из взрослых клеток, а не из эмбрионов. Поэтому стало возможным получать ИПСК от взрослых и даже пожилых пациентов.[9][72][73]

Перепрограммирование соматических клеток на iPSC приводит к омоложению. Установлено, что перепрограммирование приводит к удлинению теломер и последующему их укорочению после дифференцировки обратно в фибробластоподобные производные.[74] таким образом, перепрограммирование приводит к восстановлению длины эмбриональных теломер [75] и, следовательно, увеличивает потенциальное число клеточных делений, в противном случае ограниченное пределом Хейфлика .[76]

Однако из-за диссонанса между омоложенными клетками и окружающей нишей старых клеток реципиента инъекция его собственного ИПСК обычно приводит к иммунному ответу [77], который может быть использован в медицинских целях [78] или образованию опухолей, таких как тератома.[79] была выдвинута гипотеза о том, что некоторые клетки, дифференцированные от ESC и iPSC in vivo, продолжают синтезировать изоформы эмбриональных белков .Таким образом, иммунная система может обнаруживать и атаковать клетки, которые не сотрудничают должным образом.

Небольшая вызванная молекула Митоблок-6 может принудить плюрипотентные стволовые клетки умереть путем вызывать апоптоз (через отпуск цитохрома к через митохондриальное наружная мембрана) в плюрипотентных стволовых клетках человека, но не в дифференцированных клетках. Вскоре после дифференцировки дочерние клетки становились устойчивыми к смерти. Когда Митоблок-6 был введен в дифференцированные клеточные линии, клетки оставались здоровыми. Было выдвинуто предположение, что ключ к их выживанию лежит в изменениях, претерпеваемых митохондриями плюрипотентных стволовых клеток в процессе клеточной дифференцировки. Эта способность Митоблока-6 отделять плюрипотентные и дифференцированные клеточные линии имеет потенциал для снижения риска развития тератом и других проблем в регенеративной медицине.[81]

В 2012 году были идентифицированы другие малые молекулы (селективные цитотоксические ингибиторы плюрипотентных стволовых клеток человека-hPSCs), которые предотвращали образование тератом человеческими плюрипотентными стволовыми клетками у мышей. Наиболее мощное и селективное соединение из них (Плюризин #1) ингибирует стеароил-коа десатуразу (ключевой фермент в биосинтезе олеиновой кислоты), что в конечном итоге приводит к апоптозу. С помощью этой молекулы недифференцированные клетки могут быть избирательно удалены из культуры. Эффективной стратегией для селективного устранения плюрипотентных клеток с потенциалом тератомы является таргетинг плюрипотентных стволовых клеток-специфических антиапоптотических факторов (например, survivin или Bcl10). Однократное лечение химическими ингибиторами survivin (например, кверцетином или YM155) может индуцировать селективную и полную гибель клеток недифференцированных ВПЧ и считается достаточным для предотвращения образования тератомы после трансплантации. однако маловероятно, что какой-либо предварительный зазор, имеет возможность защитить пересадку iPSC или ESC. После селективного удаления плюрипотентных клеток они быстро восстанавливаются, возвращая дифференцированные клетки в стволовые клетки, что приводит к опухолям. это может быть связано с нарушением регуляции let-7 его целевого Nr6a1 (также известного как ядерный фактор зародышевой клетки - GCNF), эмбрионального транскрипционного репрессора генов плюрипотентности, который регулирует экспрессию генов во взрослых фибробластах после потери микроРНК miRNA.

Образование тератомы плюрипотентными стволовыми клетками может быть вызвано низкой активностью фермента PTEN, который, как сообщается, способствует выживанию небольшой популяции (0,1–5% от общей популяции) высоко опухолевых, агрессивных, инициирующих тератомы эмбриональных карциномных клеток во время дифференцировки. Выживаемость этих инициирующих тератому клеток связана с неудавшейся репрессией Nanog, а также склонностью к повышенному метаболизму глюкозы и холестерина. эти тератома-инициирующие клетки также выражали более низкое соотношение р53/Р21 по сравнению с не-опухолевыми клетками.[89] В связи с вышеуказанными проблемами безопасности, использование iPSC для клеточной терапии все еще ограничено. однако они могут быть использованы для различных других целей - в том числе для моделирования заболеваний, скрининга (селективного отбора) лекарственных средств, тестирования токсичности различных лекарственных средств

Ткани, выращенные из ИПСК, помещенные в "химерные" эмбрионы на ранних стадиях развития мыши, практически не вызывают иммунного ответа (после того, как эмбрионы выросли во взрослых мышей) и пригодны для аутологичной трансплантации В то же время полное перепрограммирование взрослых клеток in vivo в тканях путем транзиторной индукции четырех факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc у мышей приводит к появлению тератом из нескольких органов. Кроме того, частичное перепрограммирование клеток в сторону плюрипотентности in vivo у мышей демонстрирует, что неполное перепрограммирование влечет за собой эпигенетические изменения (неудавшуюся репрессию Поликомб-мишеней и измененное метилирование ДНК ) в клетках, которые управляют развитием рака.

===Химическая Основная статья: химическая биология § химические подходы к биологии стволовых клеток

Используя исключительно малые молекулы, Дэн Хункуй и его коллеги продемонстрировали, что эндогенных "главных генов" достаточно для перепрограммирования клеточной судьбы. Они индуцировали плюрипотентное состояние во взрослых клетках у мышей с использованием семи мелкомолекулярных соединений.[17] Эффективность метода достаточно высока: он смог конвертировать 0,02% клеток взрослой ткани в ИПСК, что сопоставимо с коэффициентом конверсии инсерции генов. Авторы отмечают, что мыши, полученные из Ципск, были "на 100% жизнеспособны и, по-видимому, здоровы в течение 6 месяцев". Таким образом, эта химическая стратегия перепрограммирования имеет потенциальное применение в создании функциональных желательных типов клеток для клинических применений.[96][97]

В 2015 году была создана надежная система химического перепрограммирования с выходом до 1000-кратного больше, чем у ранее представленного протокола. Итак, химическое перепрограммирование стало многообещающим подходом к манипулированию судьбами клеток. Дифференцировка от индуцированной тератомы

Тот факт, что ИПСК человека способны образовывать тератомы не только у человека, но и в организме некоторых животных, в частности у мышей или свиней, позволил разработать метод дифференцировки ИПСК in vivo. С этой целью ИПСК с агентом для индуцирования дифференцировки в клетки-мишени вводят генетически модифицированной свинье или мыши, которая подавила активацию иммунной системы на клетках человека. Сформированная тератома вырезается и используется для выделения необходимых дифференцированных клеток человека с помощью моноклонального антитела к тканеспецифическим маркерам на поверхности этих клеток. Этот метод был успешно использован для производства функциональных миелоидных, эритроидных и лимфоидных клеток человека, пригодных для трансплантации (пока только мышам). Мыши, привитые человеческими тератомными кроветворными клетками iPSC, продуцировали человеческие В-и Т-клетки, способные к функциональным иммунным реакциям. Эти результаты дают надежду на то, что in vivo генерация индивидуальных клеток пациента осуществима, предоставляя материалы, которые могут быть полезны для трансплантации, генерации антител человека и применения для скрининга лекарств. Использование Митоблока-6 и / или Плюризин # 1 дифференцированные клетки-предшественники могут быть дополнительно очищены от тератомы, образующей плюрипотентные клетки. Тот факт, что дифференцировка происходит даже в тератомной нише, дает надежду на то, что полученные клетки достаточно устойчивы к раздражителям, способным вызвать их переход обратно в дедифференцированное (плюрипотентное) состояние и поэтому безопасны. Аналогичная система дифференцировки in vivo, дающая приживляемые гемопоэтические стволовые клетки от мышиных и человеческих ИПСК у тератомоносных животных в сочетании с маневром для облегчения гемопоэза, была описана Suzuki et al. Они отметили, что ни лейкемия, ни опухоли не наблюдались у реципиентов после внутривенного введения полученных из ИПСК гемопоэтических стволовых клеток облученным реципиентам. Кроме того, эта инъекция привела к мультилинейности и длительному восстановлению гематолимфопоэтической системы при последовательных передачах. Такая система является полезным инструментом для практического применения ИПСК в лечении гематологических и иммунологических заболеваний.

Для дальнейшего развития этого метода животное, в котором выращивается клеточный трансплантат человека, например мышь, должно иметь настолько модифицированный геном, что все его клетки экспрессируют и имеют на своей поверхности человеческий SIRPa .[103] Для предотвращения отторжения после трансплантации пациенту аллогенного органа или ткани, выращенного из плюрипотентных стволовых клеток in vivo у животного, эти клетки должны экспрессировать две молекулы: CTLA4-Ig , который нарушает костимуляторные пути Т-клеток и PD-L1 , который активирует Т-клеточный ингибиторный путь.

Смотрите также: патент США 20130058900.

Дифференцированные типы ячеек

Ретинальные клетки

В ближайшем будущем начнутся клинические испытания, призванные продемонстрировать безопасность применения ИПСК для клеточной терапии людей с возрастной макулярной дегенерацией-заболеванием, вызывающим слепоту через повреждение сетчатки. Существует несколько статей, описывающих способы получения ретинальных клеток из iPSCs и как их использовать для клеточной терапии. сообщения о трансплантации ретинального пигментированного эпителия, полученного из iPSC, показали усиление визуально-ориентированное поведение экспериментальных животных в течение 6 недель после трансплантации. Тем не менее, клинические испытания были успешными: у десяти пациентов, страдающих пигментным ретинитом, было восстановлено зрение, в том числе у женщины, у которой осталось только 17 процентов ее зрения.

Эпителиальные клетки легких и дыхательных

Хронические заболевания легких, такие как идиопатический легочный фиброз и кистозный фиброз или хроническая обструктивная болезнь легких и астма, являются ведущими причинами заболеваемости и смертности во всем мире со значительным человеческим, социальным и финансовым бременем. Поэтому существует острая необходимость в эффективной клеточной терапии и легочной тканевой инженерии . Было разработано несколько протоколов для генерации большинства типов клеток дыхательной системы, которые могут быть полезны для получения специфичных для пациента терапевтических клеток.

Репродуктивные клетки

Некоторые линии ИПСК обладают способностью дифференцироваться в мужские зародышевые клетки и ооцитоподобные клетки в соответствующей нише (путем культивирования в среде для дифференцировки ретиноевой кислоты и свиной фолликулярной жидкости или трансплантации семенных канальцев). Кроме того, трансплантация ИПСК вносит свой вклад в восстановление семенника бесплодных мышей, демонстрируя потенциальную возможность получения гамет из ИПСК in vivo и in vitro. Индуцированные прогениторные стволовые клетки

Прямая трансдифференциация

Риск возникновения рака и опухолей создает необходимость разработки методов получения более безопасных клеточных линий, пригодных для клинического использования. Альтернативным подходом является так называемое" прямое перепрограммирование " – трансдифференцировка клеток без прохождения через плюрипотентное состояние. основанием для такого подхода послужило то, что 5 – азацитидин-реагент для деметилирования ДНК-может вызывать образование миогенных, хондрогенных и адипогенных клонов в бессмертной клеточной линии эмбриональных фибробластов мыши и что для такого перепрограммирования достаточно активации одного гена, позже названного MyoD1. по сравнению с iPSC, чье перепрограммирование требует не менее двух недель, образование индуцированных клеток-предшественников иногда происходит в течение нескольких дней, и эффективность перепрограммирования обычно во много раз выше. Это перепрограммирование не всегда требует деления клеток. клетки, полученные в результате такого перепрограммирования, более пригодны для клеточной терапии, поскольку они не образуют тератомы. Например, Чандракантан и др., & Pimanda описывают генерацию тканерегенеративных мультипотентных стволовых клеток (iMS-клеток) путем временной обработки зрелых костных и жировых клеток с помощью фактора роста (тромбоцитарного фактора роста- AB (PDGF-AB)) и 5-Азацитидин. Эти авторы утверждают, что:" в отличие от первичных мезенхимальных стволовых клеток, которые используются с небольшим количеством объективных доказательств в клинической практике для содействия репарации тканей, iMS-клетки вносят непосредственный вклад в in vivo регенерацию тканей контекстно-зависимым образом без образования опухолей "и поэтому" имеет значительный объем для применения в регенерации тканей."

Один транскрипционный фактор transdifferentiation

Первоначально только ранние эмбриональные клетки можно было уговорить изменить их идентичность. Зрелые клетки устойчивы к изменению своей идентичности, как только они привязаны к определенному виду. Однако кратковременная экспрессия одного транскрипционного фактора, фактора ELT-7 GATA, может преобразовать идентичность полностью дифференцированных, специализированных неэндодермальных клеток глотки в полностью дифференцированные кишечные клетки у интактных личинок и взрослых круглых червей Caenorhabditis elegans без требования к дедифференцированному промежуточному звену.

Трансдифференцирование с активатором, опосредованным CRISPR

Судьба клетки может быть эффективно манипулирована редактированием эпигенома. В частности, путем непосредственной активации специфической эндогенной экспрессии гена CRISPR-опосредованным активатором. Когда dCas9 (который был модифицирован таким образом, что он больше не разрезает ДНК, но все еще может направляться к определенным последовательностям и связываться с ними) сочетается с активаторами транскрипции, он может точно манипулировать эндогенной экспрессией генов. Используя этот метод, Wei et al., повышенная экспрессия эндогенных Cdx2 и Gata6 гены CRISPR-опосредованных активаторов, таким образом, непосредственно преобразуют эмбриональные стволовые клетки мыши в две экстраэмбриональные линии, т. е. типичные стволовые клетки трофобласта и экстраэмбриональные клетки эндодермы. аналогичный подход был использован для индукции активации эндогенных генов Brn2, Ascl1 и Myt1l для преобразования эмбриональных фибробластов мыши в индуцированные нейрональные клетки. Таким образом, транскрипционная активация и эпигенетическое ремоделирование эндогенных основных факторов транскрипции являются достаточными для конверсии между типами клеток. Быстрая и устойчивая активация эндогенных генов в контексте их нативного хроматина с помощью этого подхода может облегчить перепрограммирование с помощью переходных методов, которые избегают геномной интеграции и обеспечивают новую стратегию преодоления эпигенетических барьеров для спецификации судьбы клетки.

Поэтапное моделирование процесса регенерации

Другим способом перепрограммирования является моделирование процессов, происходящих при регенерации конечностей амфибии. У уродельских амфибий ранним этапом регенерации конечностей является дедифференцировка скелетных мышечных волокон в клетчатку, которая пролиферирует в ткани конечностей. Однако последовательная мелкомолекулярная обработка мышечного волокна миосеверином, реверсином (ингибитор киназы aurora B) и некоторыми другими химическими веществами: BIO (ингибитор гликогенсинтазы-3 киназы), лизофосфатидиновой кислотой (плейотропный активатор G-белок-связанных рецепторов), SB203580 (ингибитор киназы P38 MAP) или SQ22536 (ингибитор аденилциклазы) вызывает образование новых типов мышечных клеток, а также других типов клеток, таких как предшественники клеток жировой, костной и нервной систем.

Трансдифференцирование на основе антител

Исследователи обнаружили, что антитела, имитирующие GCSF, могут активировать ростостимулирующий рецептор на клетках костного мозга таким образом, что он индуцирует стволовые клетки костного мозга, которые обычно развиваются в белые клетки крови, чтобы стать нейронными прогениторными клетками. Методика позволяет исследователям осуществлять поиск больших библиотек антител и быстро подбирать те, которые обладают желаемым биологическим эффектом.

Перепрограммирование бактериями

Желудочно-кишечный тракт человека колонизирован обширным сообществом симбионтов и комменсалов. Исследователи демонстрируют феномен перепрограммирования соматических клеток бактериями и генерацию мультипотентных клеток из клеток фибробластов кожи взрослого человека путем включения молочнокислых бактерий эта клеточная трансдифференцировка вызвана рибосомами и "может происходить через донорские бактерии, которые проглатываются и перевариваются клетками-хозяевами, что может индуцировать рибосомный стресс и стимулировать клеточную пластичность развития."

Условно перепрограммированные ячейки

Шлегель и Лю продемонстрировали, что комбинация фидерных клеток и ингибитора Rho киназы (Y-27632) индуцирует нормальные и опухолевые эпителиальные клетки из многих тканей, чтобы пролиферировать бесконечно in vitro. Этот процесс происходит без необходимости трансдукции экзогенных вирусных или клеточных генов. Эти клетки были названы " условно перепрограммированными клетками (CRC)". Индукция CRCs происходит быстро и является результатом перепрограммирования всей популяции клеток. CRCs не экспрессируют высокие уровни белков, характерных для iPSCs или эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) (например, Sox2, Oct4, Nanog или Klf4). Эта индукция CRCs реверзибельна и удаление Y-27632 и фидеров позволяет клеткам продифференцировать нормально. технология CRC может генерировать 2 × 10 6 клеток за 5-6 дней от биопсии иглы и может генерировать культуры из криоконсервированной ткани и из менее чем четырех жизнеспособных клеток. КРК сохраняют нормальный кариотип и остаются нетуморигенными. Этот метод также эффективно устанавливает культуры клеток из опухолей человека и грызунов.

Способность быстро генерировать большое количество опухолевых клеток из небольших биопсийных образцов и замороженных тканей предоставляет значительные возможности для клеточной диагностики и терапии (в том числе для определения химиочувствительности) и значительно расширяет ценность биобанкинга. используя технологию CRC, исследователи смогли определить эффективную терапию для пациента с редким типом опухоли легких. группа англичанина описывает фармакогеномную платформу, которая облегчает быстрое обнаружение комбинаций лекарственных средств, которые могут преодолеть сопротивление с помощью системы CRC. Кроме того, метод CRC позволяет проводить генетическую манипуляцию эпителиальными клетками ex vivo и их последующую оценку in vivo в том же хозяине. В то время как первоначальные исследования показали, что совместное культивирование эпителиальных клеток со швейцарскими 3t3 клетками J2 было необходимо для индукции CRC, с трансвелловскими культуральными пластинами физический контакт между питателями и эпителиальными клетками не требуется для индукции CRC и, что еще более важно, для этой индукции требуется облучение питательных клеток. В соответствии с экспериментами transwell, кондиционированная среда индуцирует и поддерживает CRCs, что сопровождается сопутствующим повышением активности клеточной теломеразы. Активность кондиционированной среды напрямую коррелирует с радиационно-индуцированным апоптозом питательных клеток. Таким образом, условное перепрограммирование эпителиальных клеток опосредовано комбинацией Y-27632 и растворимого фактора(ов), высвобождаемого апоптотическими питательными клетками.

Riegel et al. демонстрируют, что мышиные клетки ME, выделенные из нормальных молочных желез или из вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV)-Neu–индуцированных опухолей молочной железы, могут культивироваться бесконечно в качестве условно перепрограммированных клеток (CRCs). Маркеры клеточной поверхности, ассоциированные с прародителями, быстро индуцируются в нормальных мышиных ME-CRCs относительно клеток ME. Однако экспрессия некоторых субпопуляций предшественников молочной железы, таких как CD49f+ ESA+ CD44+, значительно снижается в более поздних пассажах. Тем не менее, мышиные ME-CRC, выращенные в трехмерном внеклеточном матриксе, дали начало ацинарным структурам молочной железы. ME-CRCs, выделенные из трансгенных опухолей молочной железы мышей линии MMTV-Neu, экспрессируют высокие уровни HER2/neu, а также маркеров опухолевых клеток, таких как CD44+, CD49f+ и ESA+ (EpCam). Эти паттерны выражения поддерживаются в более поздних пассажах CRC. Раннее и позднее прохождение ME-CRCs от опухолей MMTV-Neu, которые были имплантированы в молочные жировые подушки сингенных или обнаженных мышей, привело к развитию сосудистых опухолей, которые метастазировали в течение 6 недель после трансплантации. Важно отметить, что гистопатология этих опухолей была неотличима от родительских опухолей, которые развиваются у мышей с MMTV-Neu. Применение системы CRC к клеткам эпителия молочной железы мыши обеспечивает привлекательную модельную систему для изучения генетики и фенотипа нормального и трансформированного эпителия мыши в определенной культуральной среде и в исследованиях трансплантации in vivo.

Другой подход к CRC заключается в ингибировании CD47-мембранного белка, который является рецептором тромбоспондина-1. Потеря CD47 позволяет поддерживать устойчивую пролиферацию первичных эндотелиальных клеток мышей, увеличивает асимметричное деление и позволяет этим клеткам спонтанно перепрограммировать для формирования мультипотентных эмбриоидных телоподобных кластеров. Нокдаун CD47 остро увеличивает мРНК уровни c-Myc и других факторов транскрипции стволовых клеток в клетках in vitro и in vivo. Тромбоспондин-1 является ключевым сигналом окружающей среды, который ингибирует самообновление стволовых клеток через CD47. Таким образом, антагонисты CD47 позволяют клеткам самообновляться и перепрограммироваться, преодолевая негативную регуляцию c-Myc и других факторов транскрипции стволовых клеток. in vivo блокада CD47 с использованием антисмыслового морфолино увеличивает выживаемость мышей, подвергшихся смертельному тотальному облучению организма за счет повышения пролиферативной способности клеток костного мозга и радиопротекции радиочувствительных тканей желудочно-кишечного тракта.

Усилители, зависящие от происхождения

Дифференцированные макрофаги могут самообновляться в тканях и длительно расширяться в культуре. при определенных условиях макрофаги могут делиться, не теряя приобретенных ими свойств, специализируясь на иммунных клетках, что обычно невозможно с дифференцированными клетками . Макрофаги достигают этого путем активации генной сети, подобной той, что обнаружена в эмбриональных стволовых клетках. Анализ одной клетки показал, что, in vivo пролиферирующие макрофаги могут депрессировать репертуар специфических для макрофагов усилителей, связанных с сетью генов, контролирующих самообновление. Это произошло, когда концентрации двух транскрипционных факторов, названных MafB и c-Maf, были естественно низкими или ингибировались в течение короткого времени. Генетические манипуляции, которые выключили MafB и c-Maf в макрофагах, заставили клетки начать программу самообновления. Подобная сеть также контролирует самообновление эмбриональных стволовых клеток, но связана с различными эмбриональными стволовыми клетками-специфическими усилителями.

Таким образом, макрофаги, выделенные из MafB - и c-Maf-двойных дефицитных мышей, делятся бесконечно; самообновление зависит от c-Myc и Klf4 .

Косвенное преобразование родословной

Косвенная конверсия линий представляет собой методику перепрограммирования, в которой соматические клетки переходят через пластическое промежуточное состояние частично перепрограммированных клеток (pre-iPSC), индуцированное кратковременным воздействием факторов перепрограммирования с последующей дифференцировкой в специально разработанной химической среде (искусственной нише).

Этот метод может быть как более эффективным, так и более безопасным, поскольку он, как представляется, не вызывает опухолей или других нежелательных генетических изменений и приводит к гораздо большей отдаче, чем другие методы. Однако безопасность этих камер остается под вопросом. Поскольку преобразование линий от пре-iPSC зависит от использования условий перепрограммирования iPSC, часть клеток может приобрести плюрипотентные свойства, если они не остановят процесс де-дифференцировки in vitro или из-за дальнейшей де-дифференцировки in vivo.

Гликопротеин наружной мембраны

Общей особенностью плюрипотентных стволовых клеток является специфический характер белкового гликозилирования их наружной мембраны. Это отличает их от большинства неплюрипотентных клеток, хотя и не белых кровяных телец . гликаны на поверхности стволовых клеток быстро реагируют на изменения состояния клеток и сигнализацию и поэтому идеально подходят для выявления даже незначительных изменений в клеточных популяциях. Многие маркеры стволовых клеток основаны на поверхностных гликановых эпитопах клеток , включая широко используемые маркеры SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81. Suila Heli et al. предполагают, что в человеческих стволовых клеток внеклеточных о-GlcNAc и внеклеточных о-LacNAc, играют решающую роль в доработке Нотч сигнального пути - высоко консервативный клеточной сигнальной системы, которая регулирует клеточный судьба спецификации, дифференциации, лево–правой асимметрии, апоптоз, somitogenesis и ангиогенез играет ключевую роль в клеточной пролиферации (обзор Perdigoto и Бардин и Джафар-Неджад и соавт.)

Изменения гликозилирования белков наружной мембраны являются маркерами состояний клеток, так или иначе связанных с плюрипотентностью и дифференцировкой. изменение гликозилирования, по-видимому, является не только результатом инициализации экспрессии генов, но и выполняет роль важного генетического регулятора, участвующего в приобретении и поддержании недифференцированного состояния.

Например, активация гликопротеина ACA, связывающего гликозилфосфатидилинозитол на поверхности клеток-предшественников в периферической крови человека, индуцирует повышенную экспрессию генов Wnt, Notch-1 , BMI1 и HOXB4 через сигнальный каскад PI3K / Akt / mTor / PTEN и способствует формированию самообновляющейся популяции гемопоэтических стволовых клеток.

Кроме того, дедифференцировка клеток-предшественников, индуцированная ACA-зависимым сигнальным путем, приводит к появлению ACA-индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, способных дифференцироваться in vitro в клетки всех трех зародышевых слоев . Изучение способности лектинов поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток человека привело к открытию лектина Erythrina crista-galli (ECA), который может служить простой и высокоэффективной матрицей для культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека.

Перепрограммирование с помощью физического подхода

Белок клеточной адгезии е-кадгерин незаменим для надежного плюрипотентного фенотипа . во время перепрограммировать для поколения клетки ИПС, Н-кадхерин может заменить функцию е-кадхерина.[173] эти функции кадгерина напрямую не связаны с адгезией, поскольку морфология сферы помогает поддерживать "стволовость" стволовых клеток.[174] Кроме того, образование сфер, обусловленное принудительным ростом клеток на низкой поверхности прикрепления, иногда вызывает перепрограммирование. Например, нейронные клетки-предшественники могут быть получены из фибробластов непосредственно с помощью физического подхода без введения экзогенных факторов перепрограммирования.

Физические сигналы, в виде параллельных микрогроов на поверхности клеточно-адгезивных подложек, могут заменить эффекты мелкомолекулярных эпигенетических модификаторов и значительно повысить эффективность перепрограммирования. Этот механизм основан на механомодуляции эпигенетического состояния клеток. В частности, "снижение активности гистоновой дезацетилазы и повышение уровня экспрессии WD – повтора домена 5 (WDR5) – субъединицы метилтранферазы Н3-микрогранулированными поверхностями приводят к усилению ацетилирования и метилирования гистона Н3". Нановолокнистые каркасы с выровненной ориентацией волокон производят эффекты, аналогичные тем, которые производятся микрогроувами, предполагая, что изменения в морфологии клеток могут быть ответственны за модуляцию эпигенетического состояния